Kapalinová chromatografie, chromatografie v plošném uspořádání

- kolonová (stac.f v koloně), plošná (stac. f. na pevné podložce, či filt. pap)

1) kapalinová chromatografie kolonová - stacionární fáze je umístěna v chromatografické koloně. Materiál je nejčastěji sklo, nebo nerez. Délka je 20-100cm. Průměr od 0,5 do 1 cm. Dnes se používají kolony o velikosti tužky, které jsou naplněny stacionární fází naprosto rovnoměrně bet mezer a v úzkém oboru zrnitosti.

a) výběr mobilní fáze - rozhodujícím jevem, který se uplatňuje při dělení směsi je rozpustnost látky v mobilní fázi a síla, jakou je látka zadržována stacionární fází. Aby došlo k dobrému oddělení složek a čas analýzy nebyl příliš dlouhý, musí být jednotlivé složky vzorku v mob. fázi optimálně rozpustné. Výběr provádíme z Eluotropní řady rozpouštědel, kde jsou rozpouštědla seřazena dle své vymývací síly. Od nejslabších - nejméně polární - (pentan, cyklohexan), přes středně polární ( chloroform, benzen), po nejsilnější - nejpolárnější - ( methanol, ethanol). V praxi se většinou používá směs dvou rozpouštědel a to polárního (methanol) a nepolárního (cyklohexan) a jejich vzájemným poměrem pak upravujeme výslednou polaritu.

- další požadavky na rozpouštědlo - nesmí reagovat se vzduchem ani se stacionární fází, nesmí být viskózní a nesmí rušit detekci.

b) gradientová eluce - Jestliže jednotlivé složky ve vzorku mají odlišný charakter co do polarity, neúměrně se prodlužuje doba analýzy. V tomto případě, po oddělení 1 série složek vyměníme rozpouštědlo za jiné o vyšší vymývací síle, eventuelně změníme poměr polárního a nepolárního rozpouštědla. Tento způsob analýzy se nazývá gradientová eluce = stupňovité vymývání
.

Schéma kapalinového chromatografu:

Popis schématu: Z1,2 - zásobní lahve s mob.f., P - počítač, I - integrátor, Z - zapisovač, D - detektor, K - kolona, DZ - dávkovací zařízení, G - zařízení pro grad. eluci, procesor, Č - čerpadlo - nejčastěji používáme peristaltické a to 2 čerpadla zapojená proti sobě, aby tok mobilní fáze byl plynulý

Detektory v kapalinové chromatografii:

- detektor musí zaregistrovat procházející složku vzorku. Musí mít proto co nejmenší signál pro mobilní fázi a co největší signál pro jednotlivé složky. platí, že vždy musíme zvolit, na kterou složku nastavíme citlivost detektoru, a ta pak má největší signál.

1) fotometrické detektory - měří absorbanci procházející kapaliny při určité vlnové délce. Nejčastěji se používají UV detektory a VIS detektory. Výhoda - jsou univerzální. Nevýhoda - velikost peaků nelze porovnávat ( mezi složkami).

2) fluorescenční detektory - fluorescence = světélkování - měří absorbanci, ale měříme jimi pouze látky, které mají fluorescenční vlastnosti = světélkují. Výhoda - detektor je velmi citlivý. Nevýhoda - málo univerzální.

3) refraktometrické detektory - měří index lomu procházející kapaliny. Výhoda - univerzální. Nevýhoda - velmi citlivé na teplotu, protože index lomu závisí na teplotě.

4) infračervené detektory - měří absorbanci v IR oblasti a používá se zejména na organické látky. Výhoda - jsou univerzální. Nevýhoda - velikost peaků nelze porovnat.

5) elektrochemické detektory - sledují elektrickou vlastnost vzorku ( vodivost) a používají se zejména na látky s redoxními účinky

Chromatografie adsorpční:

- chromatografie kapalina - pevná látka - LSC

- soustava, mezi kterou dojde k oddělení složek vzorku je adsorbent a rozpouštědlo.

- princip - rozdílná adsorpce různých složek vzorku na povrchu stacionární fáze - adsorbentu

- stacionární fáze - jsou povrchově aktivní látky - silikagel, alumina, aktivní uhlí, organické polymery

- mobilní fáze - vyrábíme z eluotropní řady s ohledem nejen na vzorek, ale také na stacionární fázi, protože neustále dochází k soutěžení molekul vzorku a mobilní fáze o místo na povrchu adsorbentu. Každá adsorpce molekuly vzorku musí být doprovázena desorpcí molekul mobilní fáze. Čím silnější je tedy vazba mezi mobilní fází a adsorbentem, tím kratší je doba analýzy.

Chromatografie rozdělovací:

- chromatografie kapalina - kapalina - LLC

- rozdělení probíhá na základě opakované extrakce mezi dvěma kapalinami - stacionární a mobilní fází. Analyzovaný vzorek se neustále rozděluje mezi obě kapalné fáze

- stacionární fáze - kapalina zakotvená na pevném nosiči silanizací, nosič musí být inertní a musí mít velký spec. povrch. Používá se silikagel, alumina, křemelina, teflon. Stacionární fáze jsou nejčastěji: trialkylchlorsírany, které reagují s nosičem.

- mobilní fáze - kapalina, vybereme z eluotropní řady

Chromatografie iontově výměnná:

- stacionární fáze - je iontoměnič, který může reverzibilně vázat ionty z roztoku. Obecná rovnice iontové výměny je MA+ B → MB + A, přičemž M = iontoměnič, A,B = ionty. Iontoměnič dělíme na katexy a anexy.

a) katexy - vyměňují z roztoku kationty a chem. obsahující karboxylové, nebo sulfoxylové funkční skupiny (-COOH, -SO₃H), přičemž vodík kyseliny vyměníme za kationt a stechiometrie je zachována. Někdy je vhodnější použít katex, který místo kyselých iontů dosazuje sodík a pak mluvíme o katexu v Na-cyklu (-SO₃Na, -COONa).

b) anexy - vyměňují z roztoku anionty a funkční skupiny jsou kvartérní amoniové báze [NR₃]⁺OH^-. Při iontové výměně je OH^- skupina opět nahrazována aniontem. Někdy je OH^- skupina nahrazena chloridovou a mluvíme o anexu v Cl^- cyklu.

- mobilní fáze - je látka schopná zpětné výměny iontů,  používá se většinou NaOH pro anexy a HCl pro katexy. Dojde k nahrazení vázaných iontů za H⁺, nebo OH^- skupinu. Tyto žíraviny (NaOH, HCl) však musí být poměrně koncentrované, aby došlo k uvolnění navázaných iontů. Proto je výhodnější v případě, kdy nám Na⁺ a Cl^- iont nevadí, použít Na nebo Cl^- cyklus, kde je mobilní fází solanka (10% roztok NaCl). Katexy jsou zpravidla částice gelů, které ve vodném roztoku bobtnají, proto je musíme před použitím nechat 24 hodin aktivovat.

- iontová výměna iontů = síla, jakou poutají ionty, závisí na: a) náboji iontů - Na⁺, Ca²⁺, Al³⁺, Ti⁴⁺ - roste síla se zvyšujícím se ox. číslem. b) na velikosti iontů, čím je iont větší, tím je silněji poután → Mg²⁺, Ca²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺ →

- výměnná kapacita ionexu - udává, kolik iontů může z roztoku vázat, udává se v mmol iontů Me²⁺/1g iontoměniče. Určuje se: a) výpočtem ze znalosti vzorce iontoměniče. b) pokusem, kdy tato hodnota bývá zpravidla nižší a iontoměnič prakticky proléváme roztokem iontů a sledujeme, kolik jich je iontoměnič schopen navázat. Statický - 1 g iontoměniče smícháme s roztokem NaCl a filtrujeme NaOH uvolněné H⁺ ionty. Dynamický - kdy iontoměnič proléváme vodou a v proteklé vodě sledujeme tvrdost a najdeme okamžik, kdy iontoměnič přestane vázat ionty z roztoku

- použití iontoměničů -

- Demineralizace vody. V analytické chemii na odstranění iontů, které ruší stanovení. Na zakoncentrování látek z velmi zředěných roztoků.

Chromatografie gelová:

- k dělení látek dochází na základě jejich rozdílné vlastnosti, kdy molekuly vzorku vnikají do přesně definovaných pórů gelu, který tvoří stacionární fázi. Molekuly jsou pak vyplavovány mobilní fází. Kolonu pak látky opouštějí podle své velikosti (molekulové hmotnosti).

- použití - odsolování tj. oddělení anorg. solí z organických roztoků. Dělení makromolekulárních látek.

- obrázek, graf-

2) chromatografie v plošném uspořádání - stacionární fáze je nikoliv v koloně, ale je rozprostřena na ploše. Rozeznáváme buď: chromatografii na papíru - PC, nebo chromatografii na tenké vrstvě - TLC.

- princip PC - podobný LLC, kdy papír je nosič, absorbovaná vlhkost je stacionární fáze a rozpouštědlo je mobilní fáze. Postup mobilní fáze je na principu kapilariky ( povrchové napětí). během posunu papíru dochází k neustálému rozdělování molekul vzorku mezi vodou absorbovanou na papíru a rozpouštědlem. Materiál: speciální chormatografický papír s přesně definovanými póry.

- princip TLC - podobný LSC, kdy stacionární fází je adsorbent (silikagel, aluminát) nanesený na tenké podložce (sklo, Al - folie, plast) z inertního materiálu, na který se nám molekuly vzorku různou silou absorbují. Mobilní fáze je zde opět rozpouštědlo. Mobilní fáze - směs rozpouštědel ( aceton, HCl, voda) nebo (butanol, kys.octová, voda)

- kvalita, kvantita - výsledný chromatogram nám vyjeví soubor skvrn, kdy poloha skvrny nám udává kvalitu a velikost skvrny nám udává kvantitu

- kvalita - 1) rozpouštědlo vždy necháme vyvzlínat pouze asi 1 cm od okraje a konec papíru označíme čelo. 2) na počátku označíme - start a na něj naneseme směs látek (vzorek). 3) kvalitu udává retenční faktor (poměr) Rf = a/b = vzdálenost skvrn / vzdálenost čelo až start

- kvantita - dána velikostí skvrny, ale změření průměru je velmi nepřesné. O něco přesnější výsledky dostaneme, jestliže skvrnu seškrábneme, extrahujeme, rozpustíme a stanovíme. Dnes se používá fotodenzitometrické stanovení, kdy změříme absorbanci na několika místech skvrny a obsah látky řešíme jako plošný integrál (řeší počítač). V mnoha místech skvrny změříme odražené záření, které je úměrné množství látky v daném bodě a počítač z toho spočítá objem látky ve skvrně.

- zviditelnění skvrny - před vlastním stanovením musíme zpravidla skvrny zviditelnit. Používáme k tomu acidobazické indikátory,  roztok chloridu železitého, páry jódu, kyselinu sírovou, eventuelně UV nebo IR lampu.

- způsoby vyvíjení - při vyvolání chromatogramu používáme různé způsoby vyvíjení

hodinové sklo

a) vzestupné vyvíjení - nejběžnější, kdy hodinové sklo dáme na kádinku, do které dáme rozpouštědlo a chromatografický papír

b) sestupné vyvíjení - používáme v případě , že mobilní fáze má velkou hustotu, je těžká a nebo má vysokou viskozitu

c) horizontální vyvíjení - kruhová chromatografie, mezi 2 Petriho misky vložíme chrom. papír

d) dvourovnoměrné vyvíjení - obdoba Gradiendové eluce, kdy nejprve vyvíjíme jedním rozpouštědlem a poté použijeme druhé rozpouštědlo, které rozdělí ještě některé skvrny. Chromat. papír přitom otočíme o 90°C.

- použití chromatografie na tenké vrstvě - vzhledem k tomu, že kvantitativní stanovení látek je u této metody málo přesné, používá se především ve výzkumu, pro nalezení optimální dvojice stacionární a mobilní fáze, ve zdravotnictví a v soudním lékařství k určení přítomnosti léčiv a dorg, při použití kvalitního fotodenzitometru lze tuto metodu použít i pto kvantitativní analýzu různých látek